Методика и воспроизводимость

0Задача и логика

Статья Ruan et al. (PNAS 2024) заявляет, что Ir(III)-карбеновый комплекс 1a ингибирует Girdin, докируясь в один гомологический «SH2-подобный» карман C-конца. Мы проверяем это как фальсифицируемую гипотезу: не предполагать фолд, слепо обыскать всю поверхность и заставить каждый сайт стоять или падать против измеренной SAR под шум-контролируемым, multiple-comparison-защищённым тестом. 1a — субституционно инертный октаэдр (внешнесферное связывание, форма/ван-дер-Ваальс) → докинг жёстким телом корректен.

1Программное обеспечение и версии

Окружения: проектный venv /root/girdin-dock/venv (rdkit, gemmi, meeko, biopython, numpy 1.26.4, scipy 1.11.4); металлоорганика — /root/biometaldb-3d/arch-env (Architector 0.0.10). Бинарники докинга/QM — в bin/. Compute: тривиальный (~5 c/комплекс, smina rigid, CPU); GPU не требуется.

2Мишень, лиганды, идентификаторы

Лиганды построены Architector 0.0.10 + CREST/GFN2-xTB, заряд +1, синглет; заряды — xTB-GFN2 Mulliken (не Gasteiger). Формулы < 0.7 мДа vs SI intact-cation HRMS (4/5). Ir в smina заменяется shape-суррогатом Fe (smina отвергает тип Ir); Vina-функция без кулоновского члена, поэтому заряды — только provenance (bit-identical под xTB / 0 / ±0.5 зарядами).

3SAR-оракул (эталон)

Экспериментальная SAR — фиксированный эталон, дословно из первоисточника (Fig 7E/8E/7G + SI S20). MST Kd к His-Girdin-CT 1660–1870, варьируется только 4-R:

• Signal A — 4-R существенен (R=H ≥ ~1.6 kcal/mol слабее 1a; RT·ln(20/1.3) ≈ 1.62 kcal/mol).
• Signal B — грубый хемотип: малое основное аминокольцо (1a/1d/1e) > объёмное/эфир/tert-бутил (1c/1b).
• НЕ сигнал — тонкий intra-amine порядок (~0.6 kcal/mol) на/ниже шума докинга: не воспроизводим, никогда не заявляется.

4Последовательность действий (7 стадий)

1. Stage 0 — лиганды. Построить + химически валидировать серию 1a–1e + R=H (только 4-R различается; +1 синглет; Architector/CREST/GFN2-xTB; xTB Mulliken-заряды сумма +1, без NaN).
2. Stage 1 — ансамбль рецептора. Disorder-aware ансамбль Girdin-CT: 28 членов / 5 независимых источников (AF2, ESMFold, 15 ко-фолдов Boltz-2 с Gαi3/EGFR-pY, ANM-расширение); median Cα-RMSD 20.3 Å, Rg 13–46 Å, pLDDT 23–42 (дизордер представлен честно). Окно моделирования 1690–1850; анализ 1713–1823.
3. Stage 2 — каталог карманов. per-conformer fpocket → 288 карманов → 8 рекуррентных, все транзиентные.
4. Stage 3 — слепой докинг всей поверхности. smina exhaustiveness 32, Ir→Fe shape-суррогат, rigid (TORSDOF 0), xTB-GFN2 заряды; 6 комплексов × 8 членов × 3 seed = 144 докинга.
5. Stage 4 — валидация SAR ранга. vs фиксированный Kd-эталон с пред-регистрированным шумовым порогом (MDE), пред-регистрированными Signals A/B и 720-перестановочным multiple-comparison guard.
6. Stage 5 — физический rescoring. GFN2-xTB энергия взаимодействия dE_int = E(комплекс+карман) − E(комплекс) − E(карман) лидер/самого-занятого сайта (остатки ≤ 8.0 Å; obabel -h нейтральная valence-fill; 140 поз; verify --rederive 2, |Δ|=0.0000).
7. Stage 6 — ортогональная согласованность. Gαi3/GBA pulldown; мутагенез-остатки.
8. Mission Stage 2 — жёсткие реальные поверхности. экспериментальная Gαi3-борозда (PDB 6MHF) + фосфо-сайт / крайний C-конец 1815–1871 (SEP/TPO/PTR PO₃-графтинг: P–O(ester) 1.61, P–O(term) 1.51 Å; MD-коллапс OpenMM заблокирован окружением → rigid-residue geometric collapse).

5Процедура получения рецептора и сайта связывания

Рецептор — несущий блокер всей задачи (классический RAT: верхний узел «Мишень» доминирует). Экспериментальной структуры фолда C-конца нет; регион — внутренне неупорядоченный (UniProt Disordered 1736–1871; AF-Q3V6T2-F1 pLDDT ≈31–32; ESMFold conf ≈0.4). Компактный карман из Fig-7F статьи — вероятно фосфо-индуцированный и/или партнёр-стабилизированный (Gαi3) артефакт гомологии. Процедура — не предполагать сайт, а честно смоделировать неопределённость и слепо обыскать:

• (A) Пять независимых источников геометрии вместо одной модели: AlphaFold2 (AF-Q3V6T2-F1), ESMFold (изолированный конструкт), 15 ко-фолдов Boltz-2 (Girdin-CT + Gαi3 / EGFR-pY), плюс ANM-расширение как помеченный суррогат гибкости → 28-членный disorder-aware ансамбль.
• (B) Карманы не задаются вручную: fpocket на каждом члене каталогизирует все полости (288 → 8 рекуррентных, все транзиентные) — вход слепого поиска.
• (C) Слепой докинг всей поверхности кластеризует все позы в сайты-кандидаты (B01–B04); ни один сайт не привилегирован.
• (D) Шум-контроль и защита от подгонки. Каждый сайт проходит против SAR через MDE-порог + Signals A/B + 720-перестановочный guard (expected FP ≈ 0). Anti-gaming save: сайт B04 имеет идеальный ранг (ρ=1.0), но его Signal-A gap 0.46 kcal/mol ниже его MDE 0.72 → корректно отклонён (учебниковый multiple-comparison false positive внутри шумовой полосы).
• (E) Воспроизведение и опровержение «кармана статьи». SWISS-MODEL на SOCS3/2HMH воспроизведён и протестирован идентичным протоколом; фолд опровергнут шестью методами (InterPro/Pfam, HMMER PF00017 = 0 hits, TM-align 0.11–0.13, Foldseek PDB+AFDB = 0 hits, 19.6% id) + функциональным ко-фолдом (SH2-сегмент + EGFR-pTyr = 0/5, тогда как метод восстанавливает настоящий SH2 на позитивном контроле при 2.4 Å); fpocket druggability 0.018; ligand-sized полость лишь в 1/11 моделей.
• (F) Жёсткие реальные поверхности (Stage 2) как контроль «это не просто IDR-шум»: эксп. Gαi3-борозда (6MHF) + фосфо/крайний C-конец. MDE жёсткой полости схлопнулась до seed-порога воспроизводимости 0.022 kcal/mol (≈41× плотнее IDR-полосы) → правит перестановочный null (p=0.47). Кросс-поверхностный caveat: Kd-серия — комплекс↔Girdin, НЕ ↔Gαi3.

6Результаты и вердикт

• Слепой поиск — NEGATIVE: 4 сайта (B01–B04), 0 проходят оба robust-сигнала выше шумового порога, expected FP ≈ 0 (720-перестановочный null).
• Rescoring не подтверждает самый-занятый сайт B01 (1692–1744, перекрывает GBA/Gαi3): MDE 14.22 kcal/mol; оба сигнала глубоко внутри полосы.
• «Карман статьи» воспроизводит грубую SAR (Spearman ρ=+0.83, p=0.042), но по неспецифической причине формы/размера, на опровергнутом фолде → не валидация.
• Stage 2 — Gαi3-борозда: строгий NEGATIVE (перестановка p=0.47). Механизм (не site-SAR): комплексы сильно занимают Gαi3 GBA-борозду (−9.1…−10.6 kcal/mol) → правдоподобная конкурентная блокировка Girdin (согласуется с разрушением 1a пулдауна Girdin–Gαi3).
• Фосфо/C-конец: докинг NEGATIVE; зарядо-чувствительный xTB — анионный фосфо-патч электростатически притягивает +1 катион (6/6), но не меняет ранг → generic катион–анион, не R-group SAR.

7Ограничения и оговорки

• Сайт связывания здесь — вычислительная гипотеза, не доказательство. Слепой поиск = NEGATIVE; rescoring не подтверждает; карман статьи = неспецифический шум/размер.
• Тонкий порядок не разрешён по построению — тестируемы только Signals A/B; ρ=1.0 у B04 внутри шума и не заявляется.
• MDE консервативна (docking 0.7–1.1; xTB ~14 kcal/mol — больше всего ~0.8 kcal/mol диапазона SAR) → честные негативы, но смещение к false-negative по построению.
• Сэмплинг неполный и частично замещён: два GPU/host-сэмплера были заблокированы окружением → ANM как помеченный суррогат (не MD); крайний C-конец 1815–1871 в Stage 1 не сэмплирован (добран в Stage 2).
• Лимиты докинга: smina/Vina без кулоновского члена; Ir = Fe shape-суррогат; жёсткое тело (оправдано для инертного октаэдра; запрещает induced fit). GFN2-xTB rescoring — газовая фаза на усечённом нейтральном кармане (идентично по комплексам, но не свободная энергия).
• Нумерация несущая (статья = каноника − 1).

8Литература (сверять перед цитированием)

• Первоисточник: Ruan M-L, Ni W-X, Chu JCH, et al. «Iridium(III) carbene complexes as potent girdin inhibitors against metastatic cancers.» PNAS 2024;121(25):e2316615121. doi:10.1073/pnas.2316615121; PMID 38861602; PMC11194514.
• Gαi3 + Girdin GBA: PDB 6MHF — Kalogriopoulos et al. (2019), PMID 31363053; Garcia-Marcos et al. (2009), PMID 19211784.
• SH2-подобный регион: Lin et al. (2014), PMID 25187647 (курированная REGION, без эксп. структуры). Шаблон статьи: SOCS3-SH2 PDB 2HMH.
• Докинг: Vina — Eberhardt, Santos-Martins, Tillack, Forli, JCIM 61, 3891 (2021); Trott & Olson, JCC 31, 455 (2010). smina — Koes, Baumgartner, Camacho, JCIM 53, 1893 (2013). AutoDock4 — Morris et al., JCC 30, 2785 (2009). Meeko — Forli lab.
• QM: GFN2-xTB — Bannwarth, Ehlert, Grimme, JCTC 15, 1652 (2019). CREST — Pracht, Bohle, Grimme, PCCP 22, 7169 (2020).
• Структура/карманы: fpocket — Le Guilloux, Schmidtke, Tuffery, BMC Bioinformatics 10, 168 (2009). AlphaFold2 — Jumper et al., Nature 596, 583 (2021). ESMFold — Lin et al., Science 379, 1123 (2023). Boltz-2 — github.com/jwohlwend/boltz. Architector 0.0.10; ANM — ProDy (Bakan, Meireles, Bahar).

9Код и данные

• Спеки: METHODOLOGY.md (полный 7-стадийный), METHODOLOGY_STAGE2.md, REPORT.md (VAL-REPORT-001), REPORT_STAGE2.md, REPORT_template_assessment_2026-07-06.md, REPORT_VAL-NUM-001_numbering.md, REPORT_VAL-INT_interactome.md.
• Stage 1: stage1/{ligands_series, ensemble, dock_setup, dock_ctrl, dock_blind, site, rescore, report} (anm_expand.py, run_blind.py, analyze_sites.py, run_rescore.py, verify_*.py).
• Stage 2: stage2/{gai3, phos, cterm, phospho_xtb} + lib_phos.py, blind_dock.py, blind_analyze.py, prep_pdbqt.py, provenance.json.
• Сайт: stage1/viewer/{index.html, methods.html, css, js, vendor, data, deploy.sh}. Markdown-версия этой страницы: REPRODUCIBILITY.md.

10Быстрый старт для воспроизведения

cd /root/girdin-dock
# Stage 0 — лиганды 1a-1e + R=H (Architector/CREST/GFN2-xTB, +1 синглет, xTB Mulliken)
PY=/root/biometaldb-3d/arch-env/bin/python3
$PY stage1/ligands_series/conformers_charges.py <id>

# Stage 1 — disorder-aware ансамбль (28 членов / 5 источников) + fpocket каталог
cd stage1/ensemble && python build_members.py && python analyze_ensemble.py
python verify_selfcheck.py            # независимая Biopython-перепроверка: ALL CHECKS PASS
python run_fpocket.py && python catalogue_pockets.py

# Stage 3 — слепой докинг всей поверхности (144 докинга; smina exh 32, Ir->Fe, rigid, xTB заряды)
cd ../dock_blind
../../venv/bin/python3 prep_ligands.py && ../../venv/bin/python3 prep_receptors.py
../../venv/bin/python3 run_blind.py

# Stage 4 — сайты + SAR + MDE + 720-перестановочный guard
cd ../site && ../../venv/bin/python3 analyze_sites.py     # -> NEGATIVE; expected FP = 0

# Stage 5 — GFN2-xTB rescoring лидера/сайта B01
cd ../rescore && ../../venv/bin/python3 run_rescore.py
../../venv/bin/python3 verify_rescore.py --rederive 2       # |Δ| = 0.0000

# Stage 2 (mission) — Gαi3 борозда (6MHF) + фосфо/C-конец
cd ../../stage2 && python prep_pdbqt.py && python blind_dock.py && python blind_analyze.py

# Публикация сайта
cd /root/girdin-dock/stage1/viewer && bash deploy.sh   # -> Caddy /var/www/girdin-ir